蘇木素與胰蛋白酶作用的性質解析

目的認識蘇木素對胰蛋白酶作用活性的影響及蘇木素對胰蛋白酶作用的熒光性質。方法用酶活性法觀察蘇木素對胰蛋白酶活性的影響；用紫外光譜和熒光光譜研究蘇木素對胰蛋白酶作用的光譜性質。結果蘇木素對胰蛋白酶活性可產生競爭性抑制，抑制劑常數K1=6.13×10-5 mol/L；蘇木素對胰蛋白酶的熒光猝滅效應為靜態猝滅；蘇木素與胰蛋白酶之間的作用力主要表現為氫鍵和范德華力。結論蘇木素可使胰蛋白酶分子中的色氨酸所處環境的疏水性增強，使胰蛋白酶分子構象發生變化。

1 器材

　　1.1 儀器熒光分光光度計；雙光束紫外可見分光光度計TU－1901；pH－3C型酸度計。

　　1.2 藥品牛胰蛋白酶（生化試劑）；蘇木素（生物染色劑BS）；硼酸（分析純 ）。

　　2 方法

　　2.1 蘇木素對胰蛋白酶活性影響在恒溫水浴箱中將酪蛋白、胰蛋白酶和蘇木素預熱，按酶活性的測定方法，在胰蛋白酶與酪蛋白的酶解反應體系中加入不同體積的蘇木素溶液，測定蘇木素對酶活性的影響。胰蛋白酶活性及抑制常數測定參照文獻方法操作。

　　2.2 蘇木素對胰蛋白酶紫外光譜的影響配制pH＝7.5的硼酸緩沖溶液（內含0.1 mol/L CaCl2維持離子強度）；用硼酸緩沖溶液配制1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液，再用3次蒸餾水分別配制2.0×10-3mol/L和1.0×10-3mol/L的蘇木素溶液。

室溫條件下，在1 cm×1 cm的石英比色皿中準確加入1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液3.0 ml，掃描190～350 nm的吸收光譜。然后用微量注射往其中準確加入1.0×10-3mol/L的蘇木素溶液10 μl，混勻，靜置2 min后掃描190～350 nm的吸收光譜。掃描1.0×10-3 mol/L蘇木素溶液190～350 nm的吸收光譜。

　　2.3 蘇木素對胰蛋白酶熒光光譜影響在1 cm×1 cm的石英比色皿中準確加入 1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液3.0 ml，用微量注射器分別加入2.0×10-3mol/L的蘇木素溶液0，10，20，30，40，50，60，70 μl。每次加入后混勻，放置5 min，分別在20，25，30，35℃下，測定其熒光光譜，激發波長為280 nm，繪制288～450 nm的熒光光譜。

　　2.4 蘇木素對胰蛋白酶作用的同步熒光將“2.3”項下所配的溫度為298 K的溶液，固定激發和發射波長間隔△λ分別為20 nm和60 nm，同時掃描激發和發射波長并記錄同步熒光光譜。

　　3 結果

　　3.1 蘇木素對胰蛋白酶活性的影響蘇木素對胰蛋白酶有抑制作用，當蘇木素濃度為4.5×10-4 mol/L時，蘇木素使胰蛋白酶的相對活性下降到70.2%，抑制率為29.8%。在不同的底物濃度（40，30，20，10 g/L酪蛋白溶液）下，按酶活性的測定方法測定酶的反應速度，其結果以1/v對抑制劑量用Dixon作圖法求出Ki=6.13×10-5mol/L，抑制類型為非競爭性抑制。

　　3.2 蘇木素對胰蛋白酶紫外吸收光譜影響圖1為T＝298K，pH＝7.4時的吸收光譜。蛋白質分子中的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸殘基均有紫外吸收，蛋白質的吸收波長一般在280 nm附近。從圖1可以看出，當往胰蛋白酶中加入蘇木素后，混合溶液在280 nm附近的吸收峰均明顯增高，說明蘇木素與胰蛋白酶之間發生了作用，改變了胰蛋白酶的構象,而這種作用有利于胰蛋白酶分子中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸殘基的π－π*電子躍遷。
　
　　3.3 熒光光譜以λex＝280 nm，胰蛋白酶在354 nm附近有很強的熒光峰；而以同樣激發波長激發蘇木素溶液，在354 nm附近則沒有熒光峰，證明蘇木素不會產生與胰蛋白酶干擾的熒光。固定胰蛋白酶的量，隨著體系中蘇木素濃度的增加，胰蛋白酶的內源熒光產生有規律的猝滅，其zui大發射波長未發生明顯的變化。

3.4 熒光猝滅常數及猝滅機理

　　3.4.1 蘇木素對胰蛋白酶的猝滅效應一般情況下，可依據不同溫度下的結果區別是動態猝滅，還是靜態猝滅。對于動態猝滅，隨著溫度升高，將增加離子有效碰撞的數目，加劇電子的轉移，使熒光物質的猝滅常數隨溫度的升高而增大。而對于靜態猝滅則溫度升高將降低復合物的穩定性，使猝滅常數減小。本文以相同的實驗條件，分別測定了在20，25℃ 下胰蛋白酶的熒光猝滅光譜，以［F0/F－1］對［C］作Stern－Volmer圖。從圖3可以看出蘇木素在溫度低于25℃時猝滅常數隨溫度的升高而降低，即符合靜態猝滅機理。
當猝滅體分子和熒光物質分子之間形成新的復合物而發生靜態猝滅時，服從Lineweaver-Burk方程。20，25℃時以（F0－F）－1對［C］－1擬合Lineweaver-Burk方程，由圖4可見該雙倒數呈現良好的線性關系，再次確定在20，25℃時為靜態猝滅。
　
　　3.4.2 結合位點數n及結合常數KA的計算設蘇木素與胰蛋白酶形成n個結合點位的復合物則有：

Lg［（F0－F）/F］＝lgKA+nlg［C］

分別作不同溫度下Lg［（F0－F）/F］－lg［C］的雙對數擬合，得到不同溫度下的KA和n。 蘇木素與胰蛋白酶的結合常數，結合位點數及相應的相關系數
　
　　3.4.3 作用力類型的確定猝滅體與生物大分子之間的相互作用力主要有氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力。根據以下公式計算。 蘇木素與胰蛋白酶作用的熱力學參數

ln（K2/K1）=△H（1/T1-1/T2）/R

△G=-RTlnK

△S=（△H-△G） /T

　 由上可知，△H＜0和△S＜0，可以說明蘇木素與胰蛋白酶之間的作用力主要表現為氫鍵和范德華力。

　　3.4.4 蘇木素對胰蛋白酶構象的影響固定激發波長與發射波長的間距△λ，掃描同步熒光光譜，這種光譜可用于蛋白質構象變化的分析,由（a）△λ＝20 nm所得到的同步熒光光譜圖僅顯示的是酪氨酸殘基的熒光，（b）△λ＝60 nm時僅表現出色氨酸殘基的熒光，由圖5可以看出在此實驗條件下，酪氨酸和色氨酸殘基熒光同時被猝滅，使其熒光強度下降，酪氨酸殘基的zui大發射波長沒有發生改變，但色氨酸殘基的zui大發射波長發生了藍移，表明色氨酸基所處環境的疏水性增強，引起了胰蛋白酶的構象變化。