試驗原理：

VEGF-D試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知VEGF-D濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將VEGF-D和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中VEGF-D的濃度呈比例關系。

試劑盒內容及其配制：

自備材料：

1．   蒸餾水。

2．   加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。

3．   振蕩器及磁力攪拌器等。

樣品收集、處理及保存方法：

1、   血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2、   血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、   細胞上清液---1000×g離心10分鐘除顆粒和聚合物。

4、   組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液

5、   保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項：

l        試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

l        實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

l        不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

l        使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

l        使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

l        底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

l        加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

l        按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

安全性：

1．   避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2．   實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3．   不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

試劑的準備：

1．   標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：

2．   洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

試劑盒性能：

1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應。

3. 重復性：板內、板間變異系數均小于10%。

操作步驟：

1．   使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。

2．   根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。

3．   加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。

4．   甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

5．   每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6．   甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

7．   每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。

8．   取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。

9．   在450nm波長處測定各孔的OD值。

結 果 判 斷 與 分 析：

1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的VEGF-D標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的VEGF-D含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度, 再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

3、檢測值范圍：0-800pg/ml

4、敏感度： 0.1 pg/ml

5、正常參考值：＜351.7pg/ml