ELISA試劑盒檢測試劑每次試驗、每塊扳上都要設置以下3項對照和用途：
1．空白對照：僅用稀釋液代替檢測樣本、ELISA試劑盒用來觀察zui終反應的顯色“本底"、ELISA試劑盒并用于酶標儀消除、扣除“本底"，也就是說：以本底為“零"讀取陽性、陰性對照孔和樣本檢測孔的吸光值（A）；或者，在計算陰性對照均值（NCx）、陽性對照均值（PCx）、樣本讀數的S/C.O.值時減去空白對照的本底吸光值。早期的酶標儀沒有自動扣除空白對照孔讀數的功能，ELISA試劑盒這種酶標儀現在已經被淘汰了，寫上這段話的目的是補充說明設置空白對照的用途。空白孔具體如何讀取讀數，應該按照說明書操作。
2．陰性對照：
（1）陰性對照的含義與要求：ELISA試劑盒所謂陰性對照，是本次檢測試驗中采用與待檢測物（樣品、人用試劑就是人的血清等）具有同源性和同質性，又不含有待檢物質，并且能夠客觀比較和鑒別處理因素（血清免疫學試驗中有特異性抗原與抗體反應）之間的差異。因此，用動物血清或其制品代替陰性人血清作為對照品，無論是從理論還是實踐上都是不可取的。注意：據我所知，國產ELISA試劑盒中，有的廠家是用動物血清制品稀釋配置或與部分人血清混合配置的；陰性對照讀數，并不是“越低越好"。NCx值接近0.00X水平，這是假象！試想一下，真正采用“陰性人血清"的陰性對照品，NCx值會如此之低嗎？例如，雅培乙肝六項ELISA試劑盒的NCx值，分別為：0.010（HBsAg）、0.027（抗—HBs）、0.035（HBeAg）、1.083（抗—HBe）、1.065（抗—HBc）、0.045（抗HBc-IgM）。生物梅里埃的HIV試劑NCx是0.091。辨別試劑NCx值是否合理的一個很簡單的方法，只要對比大量陰性樣本的實際讀數就“一目了然"啦！
（2）陰性對照分為兩類
一是受檢人血清中并不含有或方法學靈敏度未能檢出的待檢物的基準水平，并且結果判斷值（Cut off）計算式中決定“是"（陽性）、或“否"（陰性）的*可變值。陰性對照值高，導致假陰性；反之，ELISA試劑盒導致假陽性。二是陰性對照設置，在方法學上要求加入指示性定量標準品，ELISA試劑盒如中和劑HBeAg，定量HBcAg等，用以檢測抗—HBe、抗—HBc。或者，選取代表平均水平的正常人血清用作陰性對照，ELISA試劑盒如檢測抗—HBc IgM。此類Cut off 值計算時，多數均包括陰性和陽性對照值2個可變值。